介紹
蛋白質(zhì)是生命體內(nèi)構(gòu)成酶、激素、抗體等重要生物大分子物質(zhì)的基礎(chǔ)。水解是蛋白質(zhì)的一種常見處理方式，可以將蛋白質(zhì)分解成更小的肽鏈或氨基酸。蛋白質(zhì)水解度是評估蛋白質(zhì)加工過程中的關(guān)鍵指標(biāo)之一。為了考慮到不同蛋白質(zhì)的特性，不同的蛋白質(zhì)水解度測定方法也應(yīng)運(yùn)而生。本文將介紹一些蛋白質(zhì)水解度測定方法的原理和應(yīng)用。
方法1：酸水解法
酸水解法利用酸強(qiáng)烈的氧化性破壞蛋白質(zhì)物質(zhì)，進(jìn)而作用于二硫鍵和非極性氨基酸。 具體而言，樣品加入6 mol/L 的HCl 和無水甲醇溶液中，然后在110℃和60分鐘的條件下孵化。之后，去除樣品中的甲醇，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH（~7.0至~7.5），使用UV-vis分光光度計在280nm測定釋放的氨基酸的吸光度。該方法的缺點(diǎn)是：高濃度HCl可能導(dǎo)致非特異性氨基酸水解失真，對二硫鍵的物理破壞和蛋白質(zhì)的部分損失。此外，任何無水醇都不能與蛋白質(zhì)樣品有直接接觸的風(fēng)險。
方法2：酶水解法
酶水解法采用酶水解蛋白質(zhì)，最常用的酶是胃蛋白酶、胰蛋白酶以及產(chǎn)酸和產(chǎn)堿菌酶等。該方法依靠酶切了蛋白質(zhì)樣品所釋放出的肽鏈，測量其的吸光度，或使用拉曼光譜、質(zhì)譜等儀器測定。酶水解法具有低度特異性，沒有和酸水解法類似的問題，能夠保留樣品真實(shí)性，但是對于有些蛋白質(zhì)，比如毛細(xì)管電泳研究，胰蛋白酶的剪切作用可能會產(chǎn)生假象。
方法3：紫外線法
紫外線法是無損傷物理法測定蛋白質(zhì)水解程度的一種，使用UV-Vis光譜儀深入樣品測定。對于這種的蛋白質(zhì)溶液，通過光譜研究，可以檢測出一些與化學(xué)具有結(jié)構(gòu)特異性的指標(biāo)，如酪氨酸、苯，酪氨酸和三個氨基酸組成的物質(zhì)，可以確定水解程度。根據(jù)Johnson&Johnson (2014)發(fā)表的論文，通過該方法對蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)破壞階段、副反應(yīng)發(fā)生時過程會有指示性的反應(yīng)。此方法在生產(chǎn)環(huán)境中非常有實(shí)用意義，但需要儀器學(xué)專業(yè)知識進(jìn)行分析。
總結(jié)
綜上所述，酸水解法、酶水解法和紫外線法在測定蛋白質(zhì)水解度方面都有一定的優(yōu)缺點(diǎn)。選擇適合的方法依賴于具體的樣品和試驗(yàn)?zāi)康?。這些方法讓我們更好地了解了蛋白質(zhì)水解程度的多個方面，為生物化學(xué)和制藥等領(lǐng)域的研究、生產(chǎn)工作提供了便利。
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